"Сто лет хроматографии"

В. А. Даванков, Я. И. Яшин

ВЕСТНИК РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК
том 73, № 7, с. 637-646 (2003)

21 марта 1903 г. Михаил Семенович Цвет, в то время работавший в должности ассистента (официально - в должности внештатного лаборанта) кафедры анатомии и физиологии растений Варшавского университета, прочитал свой знаменательный доклад "О новой категории адсорбционных явлений и о применении их к биологическому анализу" (Труды Варшавского общества естествоиспытателей. Отд. биологии. 1903. Т. 14. С. 1-20). Эксперименты в области адсорбции, приведшие в итоге к открытию хроматографии, ученый начал двумя годами раньше - в возрасте 28 лет. Подробное изложение принципов и возможностей своего хроматографического метода он дал в 1906 г. в двух статьях на немецком языке и в книге 1910 г. "Хромофиллы в растительном и животном мире".

По экспертным оценкам, хроматография относится к 20 выдающимся открытиям прошедшего столетия, которые в наибольшей степени преобразовали науку, а через нее определили уровень развития техники и промышленности, цивилизации в целом. Хотя по образованию и роду занятий Цвет был ботаником, результаты его открытия столь значимы для всех естественных наук, что Федерация европейских химических обществ, например, приводит имя Цвета, наряду с четырьмя другими русскими именами - Ломоносова, Менделеева, Бутлерова и Семенова, - в числе ста выдающихся химиков прошлого.

В конце своего 100-летия хроматография представляет собой:

самый распространенный и совершенный метод разделения смесей атомов, изотопов, молекул, всех типов изомерных молекул, включая и оптические изомеры, макромолекул (синтетических полимеров и биополимеров), ионов, устойчивых свободных радикалов, комплексов, ассоциатов, микрочастиц;

уникальный метод качественного и количественного анализа сложных многокомпонентных смесей:

самостоятельное научное направление и важный физико-химический метод исследования и измерения;

препаративный и промышленный метод выделения веществ в чистом виде;

мощную отрасль научного приборостроения.

Ни один аналитический метод не может конкурировать с хроматографией по универсальности применения и эффективности разделения самых сложных многокомпонентных смесей. На современных газохроматографических капиллярных колонках в одном эксперименте могут быть разделены более 1000 индивидуальных компонентов, например, в бензиновых фракциях нефти; двумерный электрофорез позволяет увидеть до 2000 белков в биологических объектах или пептидов в гидролизатах белков. Только благодаря сочетанию разнообразных методов хроматографии и капиллярного электрофореза стала возможной расшифровка нуклеотидной последовательности ДНК и завершение работ по программе "Геном человека". Используя хроматографию, можно определить содержание супертоксикантов, в частности, полихлорированных диоксинов в объектах окружающей среды при крайне низких концентрациях этих веществ (10-10%).

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ХРОМАТОГРАФИИ

Хроматография изучает термодинамику состояния двухфазных систем газ-жидкость, жидкость-жидкость, жидкость-твердое тело, сверхкритическое и жидкокристаллическое состояние веществ, исследует природу межмолекулярных взаимодействий, кинетику процессов внутреннего и межфазного массообмена, процессы комплексообразования, ассоциации и образования соединений включения, стереохимию органических соединений и многое другое.

В связи с исключительной многогранностью понятия "хроматография" оно не может быть охвачено одним единственным определением. В категориях "явление, процесс, метод, наука" хроматографию предложено определять как

явление образования, движения и изменения концентрационных зон веществ (частиц) в условиях массообмена между несмешивающимися и движущимися относительно друг друга фазами или на границе раздела этих фаз;

процесс дифференцированного многократного перераспределения веществ или частиц между несмешивающимися и движущимися относительно друг друга фазами, приводящий к обособлении) концентрационных зон индивидуальных

компонентов исходных смесей этих веществ или частиц;

метод разделения смесей веществ или частиц, основанный на различии в скоростях их перемещения в системе несмешивающихся и движущихся относительно друг друга фаз;

наука о межмолекулярных взаимодействиях и переносе молекул или частиц в системе несмешивающихся и движущихся относительно друг друга фаз.

В научной литературе встречаются и другие определения хроматографии, однако любое из них должно обязательно содержать среди отличительных видовых признаков упоминание о переносе веществ (частиц) в системе несмешивающихся и движущихся друг относительно друга фаз. Наличие как минимум двух фаз и их относительное движение, то есть динамика процесса, -неотъемлемые признаки хроматографии.

Поскольку хроматографическое разделение происходит в процессе постоянного перераспределения компонентов между неподвижной и перемещающейся фазами, взаимодействие веществ с сорбентом должно быть обратимым, то есть обеспечиваться слабыми (в условиях опыта) межмолекулярными взаимодействиями. К таким взаимодействиям прежде всего относятся дисперсионные, дипольные, ионные. Напротив, необратимая сорбция компонентов (хемосорбция) для хроматографического разделения принципиально непригодна.

При наличии двух одновременных процессов - взаимного перемещения фаз и перераспределения компонентов между фазами - принципиально важным становится соотношение их скоростей. Если второй процесс осуществляется много быстрее первого, межфазное распределение компонентов успевает достичь равновесного. В этом случае имеют дело с равновесной хроматографией, где конечный эффект разделения компонентов определяется термодинамикой системы, то есть коэффициентами межфазного распределения соединений. Если межфазное распределение компонентов за время их переноса подвижной фазой вдоль неподвижной фазы установиться не успевает, имеют дело с неравновесной хроматографией. Конечный эффект разделения здесь определяется кинетикой диффузионных процессов.

Неравновесная хроматография начала развиваться сравнительно недавно, но уже продемонстрировала свою полезность при решении некоторых специфических задач разделения ограниченного числа компонентов. Понятно, что в подавляющем числе хроматографических процессов приходится учитывать как термодинамику системы, так и кинетику переноса ее компонентов в пространстве.

Будучи не только первооткрывателем целой серии неизвестных ранее растительных пигментов, но прежде всего создателем хроматографического метода, М.С. Цвет детально разработал и теоретические, и методические основы метода. Он был превосходным и настойчивым экспериментатором. Достаточно сказать, что Михаил Семенович исследовал более ста различных по своей природе адсорбентов - как минеральных, так и органических. Хроматографические колонки Цвета, даже с точки зрения современной высокоэффективной жидкостной хроматографии, имели поразительно высокое число теоретических тарелок.

Первая мировая война затормозила и во многих направлениях прервала научные исследования Цвета. Неоднократные вынужденные переезды Варшава-Нижний Новгород-Юрьев (Тарту)-Воронеж сопровождались утратой архивов, оборудования и коллекций материалов. Нужда и физические перегрузки подорвали здоровье. Михаил Семенович Цвет скончался в 1919 г. в возрасте 47 лет. Точное место его захоронения в Воронеже неизвестно *.

(* Недавно воронежские краеведы нашли могилу ученого и установили на ней плиту с надписью: "Ему дано открыть хроматографию, разделяющую молекулы, объединяющую людей". - Прим. ред. )

Хотя ученый и был удостоен академической премии за работу по хромофиллам в растительном и животном мире, а также награжден орденами св. Станислава III и II степени (1907, 1915), орденом св. Анны III степени (1912) и юбилейной медалью в честь 300-летия дома Романовых, настоящего признания современников он все же не получил. В 1918 г. кандидатура М.С. Цвета рассматривалась в списке девяти ученых, представленных на Нобелевскую премию, но oнa была присуждена немецкому химику Ф. Хаберу.

По многим субъективным и объективным причинам хроматография мало использовалась почти три десятилетия. Можно выделить только единичные исследования, в частности Л. Пальмера в США, Ч. Дьере в Швейцарии. Т. Липпмаа в Эстонии в Тартуском университете, в котором Цвет некоторое время работал. В 1931 г. P. Кун, А. Винтерштейн и Е. Ледерер практически повторили эксперименты Цвета и убедились в огромных возможностях хроматографии. Эти ученые имели в своем распоряжении немецкий перевод книги Цвета. С середины 30-х годов началось быстрое распространение хроматографического метода в европейских странах, чему способствовали первые опубликованные на немецком языке книги по хроматографии Л. Цехмейстера и Л. Чолноки, а также Г. Хессе. Последнему автору принадлежат и первые работы по газовой адсорбционной хроматографии, увидевшие свет в 1941 г.

Перевод книги Л. Цехмейстера и Л. Чолноки на английский язык способствовал развитию хроматографии в США и Англии. Следует отметить работы английских исследователей, особенно А. Мартина и его сотрудников.

Сразу после войны к 40-летнему юбилею хроматографии в нашей стране вышел сборник избранных трудов Цвета в серии "Классики науки" под редакцией А.А. Рихтера и Т.А. Красносельской. В 1972 г. в связи со 100-летием со дня рождения Цвета было проведено несколько международных симпозиумов, в том числе в Ленинграде; Американское химическое общество учредило Международную медаль им. М.С. Цвета "За выдающиеся открытия в области хроматографии". Этой медали удостоились трое наших соотечественников: А.В. Киселев, А.А. Жуховицкий и К.И. Сакодынский. К 75-летию открытия хроматографии и юбилейному международному симпозиуму в Таллине в 1978 г. была учреждена отечественная медаль им. М.С. Цвета, которой награждена большая группа советских и зарубежных специалистов.

Из достижений отечественных ученых в теории и практике хроматографии отметим: разработку теории внешнего массообмена (А.А. Жуховицкий, А.Н. Тихонов, Я.Б. Забежинский), вывод уравнения Ван-Димтера с учетом внешнего массообмена (А.А. Жуховицкий), термодинамическую интерпретацию удерживаемого объема в газовой хроматографии (В.А. Даванков), исследование катализа методом хроматографии (С.З. Рогинский, М.И. Яновский), создание эксклюзионной хроматорафии вирусов (В.М. Коликов, Б.В. Мчедлишвилли), а также теории и практики препаративной хроматографии биологически активных амфотерных соединений (Г.В. Самсонов). Наши исследователи внесли вклад в развитие теории хирального распознавания в энантиоселективной хроматографии (В.А. Даванков) и теории нелинейной хроматографии (Ю.Я. Лебедев), в разработку методов анализа микропримесей с помощью газовой хроматографии с использованием масс-спектрометров (И.А. Ревельский), хлорированных диоксинов в окружающей среде и биопробах (Э.А. Круглов), функциональных групп полимеров хроматографией в критических условиях (А.И. Горшков, В.В. Евреинов, А.А. Горбунов) и в расширение возможностей ионной и ион-парной хроматографии (Ю.А. Золотев, О.А. Шпигун). Необходимо особо упомянуть А.В. Киселева, который, в частности, обнаружил корреляцию удерживания на плоской поверхности графитированной сажи с числом контактов молекулы сорбата на плоскости (рис. 1), а также предложил использовать хроматографию для изучения конфигурации и конформации молекул в газовой фазе, введя понятие хроматоскопии по аналогии со спектроскопией.

Рис. 1. Хроматограмма разделения пространственных изомеров пергидрофенантрена на капиллярной набивной колонке

При температуре 260°С в газохроматографической колонке дольше удерживаются те пространственные изомеры пергидрофенантрена, которые имеют больше точек соприкосновения с плоской поверхностью сорбента - графитированной термической сажей

В области приборостроения необходимо отметить несколько оригинальных отечественных разработок: хроматотермограф (А.А. Жуховицкий, Н.М. Туркельтауб, А.А. Дацкевич), газовый хроматограф "Луч-1" с фронтально-адсорбционным концентрированием легких примесей (В.И. Калмановекий, А.А. Жуховицкий, Б.К. Крылов, Я.И. Яшин), газовый хроматограф "Сигма" для анализа атмосферы Венеры (В.Н. Ротин, В.Н. Хохлов и др.), электронозахватный детектор (В.И. Калмановекий, В.Г. Шешенин), устройства для хроматомембранного метода концентрирования (Л.Н. Москвин) и газовой экстракции (Г.В. Иоффе, А.Г. Витенберг), микроколоночные жидкостные хроматографы "Милихром" и "Экохром" (С.В. Кузьмин, Л.С. Сандахчиев, М.А. Грачев, Г.И. Барам, М.П. Перельройзен). Оригинальна идея создания поликапиллярных колонок для газовой хроматографии (В.П. Солдатов), когда многие сотни коротких капилляров объединяются в пучок с синхронизированной скоростью перемещения хроматографических зон. Такая система позволяет увеличить хроматографируемую пробу при сохранении высокой эффективности капилляра (рис. 2).

Рис. 2. Скоростной анализ паров взрывчатых веществ на поликапиллярной колонке при температуре 170°С

Поликапиллярная колонка длиной всего 22 см позволяет за 2.5 минуты обнаружить и идентифицировать следовые количества паров взрывчатых веществ: 1 - 2,6-динитротолуол, 2 - 2.4-динитротолуол. 3 - 2,4,6-тринитротолуол, 4 - 3,4,5-трининитротолуол, 5 - 2.3,4-тринитротолуол, 6 - гексоген. 7 - тетрил

РАЗВИТИЕ ТЕОРИИ И МЕТОДОВ ХРОМАТОГРАФИИ

Значительные усилия хроматографистов были направлены на выявление механизмов разделения и описание размывания хроматографических зон в процессе их переноса вдоль неподвижной фазы. В итоге были получены колонки с эффективностью, близкой к теоретически возможной. Как в газовой, так и в жидкостной хроматографии успех достигнут благодаря уменьшению размера частиц сорбента или переходу к капиллярным вариантам хроматографии, где путь диффузии разделяемых молекул внутри каждой из двух фаз хроматографической системы сокращен до минимума, а поверхность раздела фаз максимально увеличена. В высокоэффективной жидкостной хроматографии заметный скачок был сделан при замене принудительного прокачивания подвижной жидкой фазы (элюента) насосами высокого давления на перемещение жидкости в результате электроосмоса в приложенном к концам капилляра электрическом поле высокого напряжения (электрохроматография).

Промежуточное положение между жидкостной и газовой хроматографией заняла сверхкритическая флюидная хроматография. В этом методе коэффициенты диффузии сорбата в сверхкритической двуокиси углерода (давление более 73 атм и температура выше 31.3°С) близки к высоким значениям коэффициентов диффузии в газах, а растворяющая способность флюида двуокиси углерода, особенно в присутствии добавок метанола, примерно такая же, как у органических жидкостей. Сверхкритическая флюидная хроматография обеспечивает высокоэффективное разделение смесей многих веществ, вплоть до олигомерных молекул, причем экологическая безвредность элюента, то есть двуокиси углерода, выгодно отличает этот метод.

Сейчас теоретики сосредоточили усилия на решении проблем селективности разделения. Изучается связь структуры исследуемых молекул с их удерживанием на сорбентах разной химической природы, разрабатываются многомерные варианты хроматографии, обеспечивающие разделение нескольких тысяч компонентов, предпринимаются попытки создать единую теорию удерживания для газовой, жидкостной и сверхкритической флюидной хроматографии, развивается теоретическое и компьютерное моделирование хроматограмм. В газовой и в высокоэффективной жидкостной хроматографии широко эксплуатируется фактор геометрического соответствия сорбата активным центрам сорбента, как это имеет место в случае применения циклодекстринов краун-эфиров, сорбентов с молекулярными отпечатками, антител, для селективного удерживания желаемых соединений или изомеров. Продолжаются исследования механизма межмолекулярных взаимодействий и удерживания в хроматографии с привлечением современных спектральных методов.

С конца 60-х годов, когда были осуществлены первые успешные разделения оптических изомеров (энантиомеров) методами газовой и жидкостной хроматографии, ведет свое начало энантио-селективная хроматография. За относительно короткий срок разработаны скоростные методы энантиомерного анализа практически всех классов органических соединений, созданы системы с симулированным подвижным слоем сорбента для многотоннажного разделения рацемических смесей на составляющие их энантиомеры. Успех энантиоселективной хроматографии способствовал бурному развитию асимметрического органического синтеза и энантиоселективного катализа, а также введению нового законодательства в области производства лекарственных препаратов, которые теперь должны исследоваться, а в большинстве случаев и производиться не в виде рацематов, а в индивидуальном энантиомерно-чистом виде.

Появились новые эффективные хиральные селекторы для распознания энантиомеров. При участии ахиральных структур минимальное число контактов с селектором, необходимое для успешной дискриминации энантиомеров, сокращается с трех до двух (рис. 3).

Весьма перспективно использование экспертных систем в описании и оптимизации хроматографических разделений, включая оптимизацию градиентного элюирования. Моделирование оказалось особенно полезным при создании препаративной и промышленной хроматографии. Большие нагрузки на сорбент и нелинейность изотерм адсорбции сорбата при высоких концентрациях потребовали разработки основ нелинейной хроматографии.

Большим достижением является теория хроматографии полимеров в критических условиях, когда сочетаются адсорбционные и эксклюзионные механизмы разделения. Этот режим хроматографии результативен и в колоночном, и в тонкослойном вариантах.

Рис. 3. Хроматограмма смеси рацемических аминокислот

Простой адсорбцией гидрофобного хирального селектора (N-гексадецил-L-оксипролина) стандартная хроматографическая колонка (LiChrosorb RP 18) длиной 10 см превращается в высокоэффективную лигандообменную колонку, количественно разделяющую каждую из шести рацемических аминокислот пробы на пары оптических изомеров

В последние годы изучается влияние температуры на процесс удерживания в высокоэффективной жидкостной хроматографии. Предложен ее высокотемпературный вариант, характеризующийся высоким разрешением и скоростями анализа. Особую роль призваны сыграть термо- и гидролитически стойкие полимерные сорбенты, поскольку колонки на силикагельной основе имеют ограниченное время жизни при высоких температурах. Многообещающей представляется оптимизация разделений при одновременном программированном изменении температуры и элю-ирующей силы элюента.

Уникальная информация получена при исследовании хроматографическим методом химической природы и свойств поверхности твердых тел: адсорбентов, катализаторов, полимеров, композиционных материалов, при изучении изменения структуры и свойств поверхности материалов в результате их термообработки, химического или адсорбционного модифицирования. Методом "обращенной" газовой хроматографии изучены фазовые переходы, имеющие место во многих полимерных материалах при повышении температуры и влияющие на кинетику диффузии тест-молекул в фазе этих полимеров. "Обращенная" жидкостная хроматография дала наиболее надежные сведения о структуре пористых полимеров разной природы, силикагелей, оксидов титана и циркония, целлюлозы, каолинитов, катализаторов и т.д., - диаметр пор и распределение их по размерам. Хроматография позволяет изучать механизмы межмолекулярных взаимодействий непосредственно на поверхности тел, механизмы адсорбции на поверхности, кинетику диффузии в жидких, жидко-кристаллических, твердых и пористых телах.

Столь же непосредственную и точную информацию о термодинамике межфазных равновесий можно получить из хроматографических параметров удерживания анализируемых соединений. Многие термодинамические измерения выполнены с помощью газовой хроматографии: определены коэффициенты адсорбции и межфазного распределения, равновесные давления паров и теплот парообразования, энтальпия адсорбции, гиббсовые энергии растворения, энтальпия донорно-акцепторных и дисперсионных взаимодействий, коэффициенты активности сорбатов и многое другое. Заметим, что полученные газо-хроматографическим методом термодинамические параметры нередко отличались от результатов определений классическими физико-химическими методами. Лишь совсем недавно одним из авторов этой статьи (В.А. Даванков) было показано, что причина расхождений кроется в ошибочном стремлении привести измеряемые параметры удерживания к стандартным условиям - температуре 273 К и давлению 1 атм. Ошибки возникли из-за отсутствия четкого определения знаменитого "фактора коррекции на сжимаемость" газовой подвижной фазы в колонке, призванного учитывать падение давления и расширение газа по мере его прохождения через колонку. В связи с этим радикальному пересмотру подверглись документы Международного союза теоретической и прикладной химии в разделе терминологии, а также рекомендации по расчету и использованию параметров удерживания в газовой хроматографии.

СОРБЕНТЫ ДЛЯ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИХ РАЗДЕЛЕНИЙ

С 1952 г. - времени открытия А. Мартином и А.Т. Джеймсом газо-жидкостной хроматографии - описано более тысячи видов стационарных жидких фаз. В аналитической практике используются в основном 10-15 типов жидких неподвижных фаз. Особенно популярны полиметилсилоксаны типа SE-30 и OV-1, которые стабильны до температуры 300-350°С в режиме программирования температуры колонки. Это - неполярные фазы, и объемы удерживания сорбатов на них практически пропорциональны их температурам кипения. Для увеличения полярности в полиметилсилоксановые фазы вводят полярные цианопропильные группы, богатые p-электронами, фенильные и др. Универсальной признана фаза полибисцианопропилфенил (14%) диметил (86%) силоксан, имеющая три типа групп. Вместо сквалана (максимально допустимая температура применения 100°С) предложена более термостабильная фаза - полиоктил (50%) метил (50%) силоксан. Большой интерес для разделения изомеров, в первую очередь оптических, представляют полисилоксановые фазы с химически связанными a, b, и g-циклодекстринами и их О-производными.

Выпускается широкий ассортимент твердых сорбентов для адсорбционной газовой хроматографии. Для разделения и анализа газов (Не, Ne, Hz, Ar, Kr, Xe, HD, D2, HT, DT, 2, O2, N2 CH4, C2H4, CD4, C2D6, CO, NO) имеются однороднопористые цеолиты (молекулярные сита) и карбосита, для универсального применения разработаны макропористые адсорбенты - силохромы, порасилы, пористые стекла, карбопаки, пористые полимеры (тенакс, хромосорб 101 и 103) и др.

И все же в газовой хроматографии наиболее распространен капиллярный метод. За рубежом более 70% анализов выполняется этим методом. Высокая разделительная способность колонок достигается за счет их большой эффективности, обусловленной минимизацией диффузионных путей сорбата как в газовой фазе, так и в предельно тонком слое сорбента. Потребителям доступны колонки с эффективностью несколько сот тысяч теоретических тарелок. На подобных капиллярных колонках разделяется до 400-500 компонентов, например бензиновых фракций нефти. Капиллярная хроматография реализуется в двух вариантах: газо-жидкостном и газо-адсорбционном. В первом варианте пленку жидкой неподвижной фазы толщиной от 0.1 мкм до нескольких микрометров наносят или химически закрепляют на внутренней поверхности полой капиллярной колонки. В газо-адсорбционном варианте на стенке капилляра создают тонкий (порядка 20 мкм) пористый слой адсорбента - полимера, силикагеля, оксида алюминия, углерода или цеолита. Такие капиллярные адсорбционные колонки высокоселективны.

Сорбенты для высокоэффективной жидкостной хроматографии чаще всего представляют собой сферические микрочастицы (диаметр 3-5 мкм) макропористых оксидов кремния, реже алюминия. Если требуется повышенная гидролитическая стабильность материала колонок, используют пористые оксиды циркония или титана. Из органических материалов применяют пористый углерод и сополимеры стирола с дивинилбензолом. При разделении низкомолекулярных соединений оптимальным считается диаметр пор жесткой матрицы сорбента 100-150 А; крупные поры около 300 А необходимы для разделения белков, нуклеиновых кислот и синтетических макромолекул. Поверхность сорбентов на основе силикагелей обычно подвергают модифицированию химической прививкой алкильных цепей, которые могут содержать и полярные функциональные группы. Для повышения химической стабильности материала и предотвращения размывания хроматографических зон за счет неконтролируемых взаимодействий с остаточными силанольными группами последние блокируются обработкой триметилхлорсиланом.

Более частое применение в высокоэффективной жидкостной хроматографии находят сорбенты с привитыми алкильными группами C8 и С18. Фирмы выпускают сотни марок подобных сорбентов, которые существенно различаются содержанием органической фазы, величинами фактора удерживания, эффективности, гидрофобности, стерической селективности, ионообменной емкости при разных значениях рН элюента, а также способностью образовывать водородные связи с сорбатом. Чтобы увеличить гидрофобность сорбентов их поверхность модифицируют перфторированными алкильными цепями; чтобы повысить селективность разделения полярных соединений, используют алкильные цепи с полярными группами в середине цепи. Кроме этих универсальных типов сорбентов, выпускаются многие десятки колонок для специальных применений: хиральные, аффинные, для разделения сахаров, аминокислот, органических кислот, лекарств, катехоламинов, прямого анализа физиологических жидкостей и т.д. Довольно модными становятся сорбенты с молекулярными "отпечатками" соединений, подлежащие селективной сорбции, но эффективность таких колонок крайне мала.

В последние годы в высокоэффективной жидкостной хроматографии все чаще применяются полимерные сорбенты на основе полистирола-дивинилбензола, оксиэтилметакрилата и др. Многообещающие результаты получены с сорбентами на основе сверхсшитого полистирола, отличающегося инертностью и совместимостью с любыми жидкими фазами. Разрабатываются материалы для перфузионной хроматографии, в которых сорбционно-активные поры среднего диаметра сочетаются со сквозными макропорами, улучшающими массообмен при высоких скоростях потока. Особо следует подчеркнуть перспективность создания монолитных сорбционных колонок. Специальными приемами полимеризации или поликонденсации формируется единый пористый блок полимерного или силикагельного материала.

ОСНОВНЫЕ ОБЛАСТИ ПРИМЕНЕНИЯ ХРОМАТОГРАФИИ

Диапазон применения хроматографических методов огромен: от анализа атмосферы планет Солнечной системы до полного анализа содержимого одной живой клетки. Исключительную роль хроматография играет в химической, нефтехимической, газовой, пищевой, целлюлозно-бумажной и многих других отраслях промышленности, прежде всего в технологическом контроле и поддержании оптимального режима производства, в контроле исходного сырья и качества готовой продукции, анализе газовых и водных сбросов производства. На каждом из 150 крупных заводов в России в технологическом контроле постоянно функционируют от 100 до 600 газовых хроматографов. Тысячи газовых, жидкостных и ионных хроматографов эксплуатируются в лабораториях Госсанэпиднадзора, экологических центрах, токсикологических лабораториях, в учреждениях Водоканала, в лабораториях Госкомгидромета, в ветеринарных лабораториях, на станциях защиты растений, в лабораториях судебной и судебно-медицинской экспертизы (табл.).

В биотехнологии хроматография является основным процессом выделения вирусов гриппа, энцефалита, бешенства и ящура, очистки вакцин, промышленного производства инсулина, других белков и полипептидов. На промышленную основу поставлено хроматографическое выделение фуллеренов, сапонинов, интерлейкина-2 человека, гистонов, плазмидов, ДНК, антибиотиков и многих других ценнейших природных и синтезируемых веществ.

Велико значение хроматографических методов в геологоразведке, в частности, в поиске газоносных и нефтеносных регионов как на суше, так и в морях, месторождений полезных ископаемых. Все чаще используется хроматография в энергетике для анализов воды на ТЭЦ и АЭС, для определения теплотворной способности природного газа. И наконец, хроматография находит применение в археологии и в искусстве при изучении старых красок, лаков, покрытий, бальзамов. Относительно новое приложение хроматографии в археологии и геологии - датирование органических останков и донных отложений путем энантиомерного анализа аминокислот. Этот метод позволяет заглянуть в прошлое на 1 млн лет, то есть глубже, чем радиоуглеродный метод, так как многие аминокислоты рацемизуются значительно медленнее, чем распадается углерод 14С.

Хроматографические методы незаменимы в контроле качества пищевых продуктов. Пищевую ценность продуктов определяют, анализируя аминокислотный состав белков, изомерный состав жирных кислот и глицеридов в жирах, углеводы, органические кислоты и витамины. В последние годы многие из этих анализов выполняются с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии. Для оценки безопасности продуктов в них выявляют пищевые добавки (консерванты, антиоксиданты, подслащивающие вещества, красители и др.), определяют свежесть продуктов, устанавливают ранние стадии порчи и допустимые сроки хранения.

В пищевых продуктах методами хроматографии можно обнаружить такие загрязняющие вещества, как пестициды, нитрозамины, микотоксины (афлатоксины, охратоксин А, зеараленон и др.), полиядерные ароматические соединения, биогенные амины, нитраты и др. Загрязнение пищевых продуктов возможно и вследствие проникновения вредных веществ из материалов упаковки, в частности, хлористого винила, бензола, пластификаторов и др. В мясных продуктах определяют анаболитические стероиды, гормоны и другие типы фармацевтических препаратов, злоупотребление которыми характерно для интенсивного животноводства. Отдельная область применения газовой хроматографии - анализ состава аромата пищевых продуктов. Обнаружены тысячи летучих компонентов, из которых лишь несколько десятков определяют характер запаха, остальные придают запаху и вкусу продукта индивидуальность.

В последние годы возникло новое направление - энантиоселективный анализ компонентов пищи. По соотношению оптических изомеров аминокислот, оксикислот и некоторых иных соединений можно однозначно установить, является ли данный продукт натуральным или содержит синтетические имитаторы и добавки. Энантиомерный анализ показал, что микроволновая обработка пищевых продуктов, в отличие от жесткой термической, не приводит к рацемизации аминокислот. Однако все молочные продукты, подвергнутые процессам брожения, содержат немало (нетоксичных) D-аланина и D-аспарагиновой кислоты - продуктов жизнедеятельности молочнокислых бактерий.

В природных жирах преобладают цис-изомеры жирных кислот. Недавно обнаружено, что транс-изомеры повышают содержание липопротеинов низкой плотности и уменьшают концентрацию липопротеинов высокой плотности в крови, что может способствовать развитию атеросклероза. Разработка методики газохроматографического разделения и анализа всех изомеров жирных кислот заставила производителей в несколько раз снизить содержание транс-изомеров ненасыщенных кислот в маргарине.

Методом газовой хроматографии в некоторых сырах выявлено много нежелательных физиологически активных биогенных аминов, и эти сорта сыра были запрещены. В Японии в пищевых продуктах используется L-триптофан, полученный с помощью генной инженерии и биотехнологии. И когда у тысяч людей обнаружили неизвестное ранее заболевание и десятки заболевших умерли, хроматографическими методами было установлено, что эти трагические последствия вызваны наличием токсичных загрязнений в триптофане (выявлено 60 примесей). Газохроматографическому анализу подвергаются вина, коньяки и другая спиртосодержащая продукция. В 1997 г. в России вышел ГОСТ по определению методом газовой хроматографии микропримесей в водке и пищевом этиловом спирте.

Хроматография активно используется для диагностики заболеваний. Хроматографический контроль биохимических маркеров и метаболитов применяется для скрининга населения и выявления опасных заболеваний, подтверждения специфических заболеваний, мониторинга эффективности терапии или появления противопоказаний, предсказания прогноза лечения, определения рецидивов заболевания. В одних случаях для надежной диагностики заболевания достаточно оценить уровень нескольких биохимических маркеров, в других - определяется метаболический профиль многих компонентов.

Биологическими маркерами являются сравнительно небольшие молекулы: катехоламины, аминокислоты (например, гомоцистеин), индолы, нуклеозиды, порфирины, сахара, стероиды, гормоны, витамины, птерины и липиды. В роли маркеров могут выступать и большие молекулы: отдельные ферменты, белки и нуклеиновые кислоты. Профиль физиологических жидкостей у пациентов с различными заболеваниями значительно отличается от профиля здоровых людей. Профильные анализы проводятся у больных с наследственными метаболическими нарушениями, при онкологических, сердечно-сосудистых, психических и неврологических заболеваниях, а также при диабете и порфириазе. Недавно было установлено, что у больных СПИДом в профиле появляются измененные нуклеозиды. В медицинских центрах различных стран по результатам анализа биохимических маркеров диагностируется более 200 метаболических болезней.

Недостаточная летучесть и нестабильность при повышенной температуре многих биологически активных соединений исключают использование газовой хроматографии при анализе биологических жидкостей, и тогда на помощь приходит высокоэффективная жидкостная хроматография. Концентрация многих маркеров в биологических жидкостях крайне низкая (10-9-10-12 г/л), поэтому нужны высокочувствительные и селективные детекторы, например амперометрический и флуоресцентный. Во многих случаях хирурги должны получать данные хроматографического анализа в крайне сжатые сроки - от 5 до 20 минут.

Анализ биологических жидкостей необходим также для исследования кинетики и селективности распределения лекарственных препаратов между различными тканями и органами, установления терапевтического уровня лекарств и скорости их выведения из организма, изучения процессов метаболизма. Вообще фармацевтические фирмы стали главным потребителем современной хроматографической аппаратуры. Поиск и создание новых лекарств, особенно с привлечением методов комбинаторной химии, теперь уже просто немыслимы без хроматографии.

Аналитический контроль важен при расследовании таких частых преступлений, как употребление наркотиков и спиртных напитков, неумышленные и умышленные отравления, злоупотребления лекарствами, а также при убийствах, пожарах, кражах, взрывах, авариях. По статистике, объектами хроматографического анализа чаще всего становятся наркотики (морфин и его производные, кокаин, каннабиноиды, ЛСД и др.), амфетамины, барбитураты, бензодиазепины, различные лекарства и яды, этанол, метанол, ацетон, изопроанол, толуол, хлороформ, дихлорэтан, этилацетат и другие растворители. Составлены обширные базы данных газохроматографических индексов удерживания и масс-спектров токсикологически значимых веществ, лекарств, ядов, пестицидов, загрязнителей и их метаболитов.

В судебной экспертизе методом хроматографии анализируют нефтепродукты и горюче-смазочные материалы, использованные в случае поджогов, выявляют факты подделок и фальсификаций горюче-смазочных материалов. Анализируют также лакокрасочные материалы и покрытия, в том числе частицы окраски автомобилей, красящие компоненты чернил для идентификации письменных материалов или определения давности документов, древесину, взрывчатые вещества, продукты взрывов и выстрела. Сотни работ опубликованы по хроматографическим анализам биологических объектов для судебной экспертизы, в частности, крови, сыворотки, мочи, слюны, пота, выдыхаемого воздуха, волос человека, образцов ткани и др.

Столь широкое использование методов хрома-тографии в контроле пищевых продуктов, промышленных процессов, мониторинге загрязнений окружающей среды, в медицине и других жизненно важных областях были бы невозможны без массового выпуска современных хроматографов. Хроматографическое приборостроение сконцентрировало в себе последние достижения микроэлектроники, пневматики, теплотехники, оптики, высокоточной механики, автоматики, микропроцессорного управления и компьютерной обработки данных. Высокий спрос на хроматографическую аппаратуру позволил фирмам-производителям вкладывать большие средства в непрерывное совершенствование хроматографов. Современная хроматография - это и мощная отрасль промышленного производства. Сотни фирм во всем мире выпускают хроматографическую аппаратуру и вспомогательное оборудование на сумму более 5 млрд. долл. ежегодно.

В последние десятилетия наметилась тенденция к миниатюризации хроматографической аппаратуры. Портативные хроматографы, сохраняющие аналитические характеристики стационарных приборов, незаменимы в полевых условиях, однако они становятся все более популярными и в лабораториях, так как потребляют меньше электроэнергии, газов-носителей или растворителей, занимают меньше места. Создаются капиллярные и наноколонки для жидкостной хроматографии, которые напрямую сочетаются с масс-спектрометрометрическим детектором. Следующий актуальный для XXI столетия уровень миниатюризации - это приборы на основе кремниевой технологии - на чипах.

Несмотря на неоспоримый приоритет и крупнейший вклад отечественных ученых в мировую хроматографию, положение России в этой области науки и техники не отличается от положения третьестепенной развивающейся страны. Наличие у нас квалифицированных кадров не может компенсировать явную неразвитость приборостроения. Большой ошибкой в свое время был курс на разработку уникальных хроматографических приборов вместо организации массового производства простых и надежных газовых и жидкостных хроматографов, создания мощной производственной базы высокоточной механики, оптики, электроники.

Роль хроматографии в XX в. нарастала с заметным ускорением. Пока нет признаков изменения этой тенденции и в нынешнем столетии. Конечно, разработка селективных сенсоров, совершенствование метода прямого инжекционного анализа, а также компьютерная поддержка таких точных методов измерения, как ЯМР и масс-спектрометрия, могут привести к автоматизации массовых рутинных анализов, однако приоритет в прямом разделении сложных смесей и получении высокочистых компонентов надолго останется за хроматографией.